一、概述
共聚焦顯微鏡不同于普通熒光顯微鏡，它利用針孔的物理限制，僅允許來自焦平面的光聚焦進(jìn)入探測器，而將焦平面上方和下方的模糊熒光信號(離焦光)阻擋在外。這帶來了顯著的優(yōu)勢：
??光學(xué)切片能力：?? 獲得樣品內(nèi)部特定深度、薄層(通常在0.5 - 2微米)的高分辨率圖像。
??更高的分辨率：?? 主要是在軸向(Z方向，沿光軸方向)分辨率顯著提高。
??背景抑制：?? 大幅減少來自非焦平面的背景噪音，提升圖像的對比度和清晰度。
??三維重建：?? 通過對樣品不同深度進(jìn)行連續(xù)掃描，可重建三維結(jié)構(gòu)。
??點(diǎn)掃描成像：?? 圖像是通過逐點(diǎn)掃描激光束并逐點(diǎn)采集信號形成的，速度通常比寬場熒光顯微鏡慢。
二、關(guān)鍵組件
1.激光光源： 提供高強(qiáng)度、單色性好、方向性好的激發(fā)光。通常配備多個不同波長的激光器，用于激發(fā)不同的熒光染料。
2.掃描裝置：
掃描振鏡： 核心部件，通常是兩個高速振動的反射鏡(X軸和Y軸)，精確控制激光束在樣本表面的掃描路徑。
掃描透鏡與管透鏡： 確保掃描光束精確聚焦在物鏡的后焦面，實(shí)現(xiàn)無畸變掃描。
3.分光鏡/二向色鏡： 將激發(fā)光反射到樣本方向，同時允許樣本發(fā)射的熒光透射到探測光路。需要根據(jù)所用熒光染料的激發(fā)和發(fā)射光譜選擇合適的鏡片。
4.物鏡： 高質(zhì)量、高數(shù)值孔徑(NA)的物鏡至關(guān)重要，它決定了系統(tǒng)的分辨率、光收集效率和成像深度。
5.共軛針孔：
照明針孔： 位于光源后，將激光變成點(diǎn)光源。
探測針孔： 位于探測器前，阻擋離焦光。針孔大小可調(diào)，是控制光學(xué)切片厚度和圖像信噪比的關(guān)鍵參數(shù)(小針孔切片薄、分辨率高但信號弱；大針孔切片厚、信號強(qiáng)但分辨率降低)。
6.探測器： 通常是高靈敏度的光電倍增管或雪崩光電二極管，將微弱的光信號轉(zhuǎn)換為電信號。
7.計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)： 控制掃描、Z軸移動、激光強(qiáng)度、針孔大小、探測器增益、圖像采集和處理等所有參數(shù)。
8.熒光濾光片組： 位于探測光路中，進(jìn)一步阻擋殘留的激發(fā)光和其他波長的雜散光，確保探測到的是特定發(fā)射波長的純凈熒光信號(發(fā)射濾光片)。
三、主要優(yōu)勢
1.高軸向分辨率(Z分辨率)與光學(xué)切片能力： 這是突出的優(yōu)勢。能清晰區(qū)分樣本中不同深度的結(jié)構(gòu)，獲得樣本內(nèi)部不同層面的清晰圖像，無需物理切片即可進(jìn)行三維成像。
2.高對比度： 有效抑制離焦背景光干擾，顯著提高圖像的清晰度和信噪比，特別適合觀察厚樣本或弱熒光信號。
3.高分辨率： 相比傳統(tǒng)寬場熒光顯微鏡，共聚焦顯微鏡的X-Y平面分辨率也有一定提升(約1.4倍)，尤其在利用某些技術(shù)后分辨率可接近光學(xué)衍射極限。
4.三維重建： 可對活體或固定樣本進(jìn)行非侵入性的三維結(jié)構(gòu)解析。
5.多通道成像： 可同時或依次使用不同波長的激光激發(fā)不同的熒光標(biāo)記物，實(shí)現(xiàn)多色標(biāo)記樣本的多通道成像，研究不同分子或結(jié)構(gòu)的共定位。
6.活細(xì)胞成像： 減少光毒性和光漂白(相對于寬場需要更短的曝光時間獲取清晰圖像)，結(jié)合合適的培養(yǎng)系統(tǒng)，可用于長時間觀察活細(xì)胞內(nèi)的動態(tài)過程。
7.圖像后處理： 強(qiáng)大的軟件支持進(jìn)行三維可視化、表面渲染、體積測量、共定位分析、熒光強(qiáng)度定量分析等。
四、主要應(yīng)用領(lǐng)域
1.細(xì)胞生物學(xué)：
細(xì)胞器結(jié)構(gòu)與動態(tài)(線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體、細(xì)胞骨架)。
細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與流動性。
細(xì)胞內(nèi)離子濃度(如Ca²?, pH)成像。
基因表達(dá)與蛋白定位。
細(xì)胞間相互作用(如免疫突觸)。
細(xì)胞遷移與分裂。
2.神經(jīng)科學(xué)：
神經(jīng)元形態(tài)與樹突棘結(jié)構(gòu)。
神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)連接。
突觸結(jié)構(gòu)與功能。
神經(jīng)遞質(zhì)釋放與受體分布。
3.發(fā)育生物學(xué)： 胚胎發(fā)育過程的三維形態(tài)發(fā)生、基因表達(dá)模式。
4.病理學(xué)與臨床診斷：
組織病理學(xué)切片分析(提供比普通光鏡更豐富的亞細(xì)胞信息)。
皮膚科在體共聚焦顯微鏡用于無創(chuàng)診斷皮膚病(如黑色素瘤)。
5.免疫學(xué)： 免疫細(xì)胞激活、遷移、與靶細(xì)胞的相互作用。
6.微生物學(xué)： 細(xì)菌、真菌在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存、生物膜結(jié)構(gòu)。
7.植物學(xué)： 植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)、細(xì)胞壁、葉綠體、基因表達(dá)。
8.材料科學(xué)： 材料表面形貌、涂層厚度、薄膜結(jié)構(gòu)、微電子器件檢測、高分子材料結(jié)構(gòu)等(常使用反射模式)。
五、關(guān)鍵注意事項(xiàng)與實(shí)踐??
??1.降低光毒性/光漂白：?? 這是活細(xì)胞成像的首要原則！
??最小激發(fā)強(qiáng)度：?? 使用??低有效??激光功率。
??最小有效曝光時間：?? 使用最快掃描速度或減少平均次數(shù)。僅在必要時才使用慢掃描和高平均。
??縮短總曝光時間：?? 避免在感興趣區(qū)域進(jìn)行不必要的預(yù)掃描和尋找焦點(diǎn)操作。盡快找到位置聚焦完成拍攝。
使用盡可能低的增益。
使用高量子效率探測器，降低激發(fā)光需求。
使用抗淬滅試劑(僅限固定樣品，活樣品可能無效或有害)。
??2.針孔調(diào)整：??
并非針孔越小越好。過小的針孔會嚴(yán)重?fù)p失信號。
只有在需要最高分辨率或研究較薄樣品結(jié)構(gòu)時，才考慮縮小針孔。
如果樣品很厚信號很弱或不需要超薄切片時，可以適當(dāng)增大針孔以獲得足夠信噪比。
??3.選擇合適的物鏡：??
??數(shù)值孔徑(NA)是分辨率的關(guān)鍵！?? 優(yōu)先選擇高NA物鏡。
浸沒介質(zhì)選擇：油鏡分辨率最高，適用于蓋玻片固定的薄樣品；水鏡適用于活細(xì)胞長時間成像(避免折射率不匹配引起的球差)；硅油或甘油鏡適用于深組織成像。
放大倍數(shù)與視野、分辨率相匹配。
??4.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：??
選擇合適的熒光染料/蛋白，確保激發(fā)波長與激光匹配，發(fā)射波段范圍與檢測通道匹配。注意熒光串?dāng)_。
預(yù)實(shí)驗(yàn)很重要：在不同條件下測試多種參數(shù)組合，找到最佳設(shè)置。
??5.儀器維護(hù)與安全：??
嚴(yán)格遵守激光安全規(guī)程：??絕對不要直視激光束！??
保持顯微鏡平臺穩(wěn)定無震動。
保持環(huán)境清潔(灰塵是光學(xué)系統(tǒng)大敵)。
定期(按規(guī)程)由專業(yè)工程師進(jìn)行系統(tǒng)校準(zhǔn)(如激光準(zhǔn)直、針孔校準(zhǔn)、PMT校準(zhǔn))。
